介绍

CAR-T，全名嵌合抗原受体T细胞，通过将设计的受体表达在T细胞上，从而让T细胞能够靶向杀死对应类型的细胞，这把刀外可杀强敌，内可斩奸臣，攻无不克，所向披靡，独领当今细胞治疗之风骚。
其中，CAR大人清君侧的故事更是人人皆知：想当初那B细胞仗着自己贵为刑部尚书，不分青红皂白，将朝廷忠臣也一并逮捕杀害，搞得朝堂之上人人自危，国家倾垂，CAR大人查明前因后果，铁面无私，果断满城张贴CD19的画像，将B细胞一系诛杀，挽狂澜于既倒，扶大厦之将倾。

TLDR：CAR-T靶向B细胞特有的CD19抗原，耗竭B细胞，从而治疗一些B细胞相关自身免疫性疾病[^1]

实验概览

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Tips：

  1. 由于本实验靶向物为内源（自体B细胞），因此筛选CD8+T，反之如果靶向外源抗原，则纯化CD4+T
  2. 实验用的逆转录病毒转染来构建，在原文献[^2]中对比了逆转录病毒和慢病毒，其中逆转录病毒效果更好，此外其他文献用逆转录病毒的也比较多。本人深以为然，毕竟激活后T细胞迅速扩增可以方便病毒侵染，并且让慢病毒感染T细胞多少有点黑色幽默了。

实验材料

自身免疫模型小鼠
CD8+T细胞系
逆转录病毒载体质粒
plat E细胞系，用于逆转录病毒包被（慢病毒用293T即可）

实验步骤

1.设计CAR序列

CAR主要由scFv+CD28跨膜段+CD3信号段组成（当然中间夹有linker），用于清除所有的B细胞。（比CD20的抗体清除B细胞效果更优）

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2.逆转录病毒转染制作CAR-T

（1）将CAR序列构建到病毒质粒中，并且在CAR序列后面加一个标记基因，此处用P2A序列+一个膜上的标记基因（这里用的Thy1.1），用于后续FC检测阳性率。
（2）在转染提取的小鼠细胞前，先转染已有的T细胞系，通过对转染后细胞进行抗原染色，流式细胞术检验看转染成功率和转染成功中的阳性率。若阳性率符合要求，再进行下一步
（3）转染（此处用的一个CD4+T细胞的例子[^3]）：

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病毒转染的详细内容知识后面会写一章病毒转染补充

3. 制备自身B细胞免疫小鼠

（1）使用含有10%合成小鼠血清的RPMI调整细胞浓度为1.2×10^7/ml
（2）尾静脉注射100μl
（3）注射后立即补充脖子注射45,000 IU的IL-2

4. 检验结果

可以用CFSE标记B细胞进行追踪
血液样品中可以用FCM测阳性率或者ELISA测抗体
此外可以针对模型小鼠监测其对应的病理学表现

参考文献：
[^1]: Kochenderfer, J.N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N.P., Rosenberg, S.A., 2010. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood 116, 3875–3886. https://doi.org/10.1182/blood-2010-01-265041（中心文献）
[^2]: Kansal, R., Richardson, N., Neeli, I., Khawaja, S., Chamberlain, D., Ghani, M., Ghani, Q., Balazs, L., Beranova-Giorgianni, S., Giorgianni, F., Kochenderfer, J.N., Marion, T., Albritton, L.M., Radic, M., 2019. Sustained B cell depletion by CD19-targeted CAR T cells is a highly effective treatment for murine lupus. Sci. Transl. Med. 11, eaav1648. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aav1648
[^3]: Eremenko, E., Taylor, Z.V., Khand, B., Zaccai, S., Porgador, A., Monsonego, A., 2021. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protocols 2, 100719. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100719